به طریق مشابه اگر I و J دو زیرمجموعه R باشند و I Í J ، آنگاه lM (J) Í lM (I) . بوضوح
I Í rR (lM (I)) و میتوان نتیجه گرفت : lM (rR (lM (I)))=lM (I) .
اگرM یک R -مدول و U یک کلاس از R – مدولها باشدTr (M ,U ) و Rej (M, U ) به صورت زیر تعریف میشوند که زیرمدولهایی از M میباشند.
Tr (M ,U )=å { Im f | f : ua → M , uaÎ U برای برخی }
Rej (M, U )=∩ {ker f | f : M → ua , uaÎU برای برخی }
اگر S مجموعه تمام R – مدولهای راست ساده باشد، به ازای هر R – مدول M،Soc (MR) بزرگترین زیرمدول نیمساده M است و با توجه به بخش 9 از مرجع [1] به صورت زیر تعریف میشود :
Soc(MR) = Tr (M ,S) = å {K | است M یک زیرمدول ساده از K }
= ∩ { L | L vess M }.
همچنین R – مدول M نیمساده است اگر و تنها اگر soc(MR) = MR .
ضمناً به سادگی دیده میشود R – مدول M نیمساده است اگر و تنها اگر زیرمدول اساسی غیر بدیهی نداشته باشد.
R – مدول M پروژکتیو نامیده میشود هرگاه به ازای هر نمودار از R- همریختیها و R- مدولها به صورت زیرکه سطر آن دقیق باشد ، R- همریختی→ A M موجود باشد بهطوریکه نمودار زیر جابجایی باشد.
1-2-1. R – مدول پروژکتیو M
یا بهطور معادل اگر هر دنباله دقیق کوتاه به صورت A→ B→ M → 0 0 → شکافته شود ، آنگاه M پروژکتیو است.
R – مدول M انژکتیو نامیده میشود هرگاه به ازای هر نمودار از R- همریختیها و R- مدولها به صورت زیرکه سطر آن دقیق باشد، R – همریختی→ M B موجود باشد بهطوریکه نمودار جابجایی باشد.
1-2-2. R – مدول انژکتیو M
این مطلب را هم بخوانید :
همچنین R – مدول M انژکتیو است هرگاه به ازای هرایدهآل راست I از R ، هر همریختی
f : I→ M را بتوان از R به M گسترش داد. (لم بئر)
1-2-3. R – مدول انژکتیوM (لم بئر)
برای اطمینان از وجود قطعه مورد نظر در پلاسمید ……………………………………………………….. 69
-۱۸ ۳- انتخاب یک یا دو کلون برای توالی یابی (برای حصول اطمینان
از توالی درست ژن)…………………………………………………………………………………………………. 69
-۱۹ ۳- پس از حصول اطمینان از توالی ژن، کلون مورد نظر برای بیان ژن
مورد استفاده قرار می گیرد…………………………………………………………………………………….. 69
۲۰-۳- خالص سازی (Purification) پروتئین های تولیدشده به فرم گنجیدگی های
درون سلولی(Inclusion body) تحت شرایط دناتوره کننده…………………………………………….. 70
۲۱-۳- حل کردن (Solubilization)و بازتاخوردگی ( Refolding) پروتئین های
تولیدشده به فرم گنجیدگی های درون سلولی (Inclusion body)…………………………………… 71
۲۲- ۳- اندازه گیری غلظت پروتئین نوترکیب NcSAG1به روش لوری………………………… 73
۲۳-۳- ارزیابی پروتئین نوترکیب خالص شده و بازتاخورده با بهره گرفتن از
SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ(Western Blotting)……………………………………………………… 74
۲۴- ۳- آزمایش وسترن بلاتینگ پروتئین ها……………………………………………………………………… 75
1-24- ۳- بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………….. 75
2-24-3- مسدود سازی سطح کاغذ (Blocking)………………………………………………………… 75
3-24- ۳- اضافه کردن سرم ضد نئوسپورا……………………………………………………………………. 76
4-24- ۳- اضافه کردن آنتی بادی کنژوگه……………………………………………………………………. 76
5-24- ۳- اضافه کردن محلول سوبسترا………………………………………………………………………… 76
۲۵- ۳- پوشاندن (Coating) ذرات لاتکس با آنتی ژن نوترکیب NcSAG1……………………. 77
۲۶- ۳- جمع آوری نمونه های سرم……………………………………………………………………………………. 78
۲۷-۳- انجام تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT) )…………………………………………………………….. 78
۲۸-۳- انجام تست الایزا……………………………………………………………………………………………………….. 79
۲۹-۳- مقایسه ارزش تشخیصی تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT) )
بر اساس آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 با تست الایزا ………………………………………………………. 79
عنوان صفحه
فصل چهارم: نتایج
۱-۴- تکثیر قسمتی از ژن NcSAG1 با روش PCR…………………………………………………………. 81
۲-۴- کلون کردن ژن NcSAG1 در پلاسمید pTZ57R/T………………………………………………. 82
۳-۴- استخراج پلاسمید از کلون 2163 E.coli GM حاوی قطعه ژنی مورد نظر
در پلاسمید pTZ57R/T………………………………………………………………………………………………………… 83
۴-۴- برش پلاسمید حاوی قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a (کلون 2821)
با آنزیم ІІІ Hind …………………………………………………………………………………………………………………. 84
۵-۴- برش قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a بریده شده با آنزیم ІІІ Hind، بوسیله
آنزیم NcoІ……………………………………………………………………………………………………………………………. 85
۶-۴- خالص سازی قطعه ژنی و پلاسمیدpET-28a بریده شده با آنزیم های
ІІІ Hind و NcoІ…………………………………………………………………………………………………………………. 86
۷-۴- کلون کردن قطعه ژنی NcSAG1 بریده شده در پلاسمید pET-28a
بریده شده با همان آنزیم ها………………………………………………………………………………………………… 87
۸-۴- نتایج بیان پروتئین نوترکیب………………………………………………………………………………………. 88
۹-۴- نتایج خالص سازی پروتئین نوترکیب تولیدشده به فرم
گنجیدگی های درون سلولی……………………………………………………………………………………………….. 91
۱۰-۴- نتایج اندازه گیری غلظت پروتئین نوترکیب NcSAG1 به روش لوری……………….. 93
۱۱-۴- نتایج حاصل از وسترن بلاتینگ پروتئین نوترکیب خالص شده
تحت شرایط دناتوره کننده…………………………………………………………………………………………………… 94
۱۲-۴- نتایج حاصل از الکتروفورز و وسترن بلاتینگ پروتئین نوترکیب بازتاخورده………… 95
۱۳-۴- نتایج حاصل از تست لاتکس آگلوتیناسیون……………………………………………………………. 95
فصل پنجم: بحث
پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………. 103
فهرست منابع و مآخذ……………………………………………………………………………….. 104
مقدمه
نئوسپورا کانینوم تک یاخته اجباری داخل سلولی از شاخه آپی کمپلکسا ، اولین بار توسط برکاس و همکارانش (۱٩۸۴) توصیف شد. دوبی و همکاران (۱٩۸۸) این تک یاخته را برای اولین بار از سگ ها جدا و نامگذاری کردند (Dubey et al. 1988a,b) سپس مشخص شد که میزبان نهائی نئوسپورا کانینوم، سگ است (Holmdahl and Mattsson 1996; Lindsay et al. 1995 Basso et al. 2001;).
نئوسپورورزیس از علل اصلی سقط جنین گاو است، از این رو با سقط ، مرده زائی، تولدگوساله ضعیف یا همراه با عفونت دائمی و کاهش تولید شیر ضررهای اقتصادی قابل توجهی ایجاد می کند. انتشار عفونت در گاو با انتقال تاکی زوئیت از مادر به جنین و یا با خوردن آب و غذائی آلوده به اووسیست انگل صورت می گیرد 1999, Trees et al. 1999; Romero et al. 2004) Dubey).
مطالعات انجام شده در برخی کشورها حاکی از این است که ۴۲-۱۳ درصد جنین های سقط شده در گاوها به این انگل آلوده هستند (Dubey and Lindsay 1993; Dubey et al. 2006 ). نئوسپورا کانینوم علاوه بر گاو ، سایر گونه های اهلی چون اسب، گوسفند، بز، شتر، سگ، گربه و سگ سانان وحشی را آلوده می کند (Dubey 2003; Gondinm 2006 ).
نئوسپوروزیس انتشار جهانی داشته و از بسیاری از کشورهای جهان گزارش شده است، ایران نیز از این قائده مستثنی نیست. در بررسی آلودگی نئوسپورا کانینوم در گاوهای شیری سقط کرده، رزمی و همکاران (۲۰۰۶) اولین مورد سقط جنین گاوی را در مشهد گزارش کردند و ۱۸/۱۵درصد نمونه های سرمی گاوها در تست IFAمثبت بودند
(et al. 2007; Sadrebazzaz et al. 2004 Razmi).
با توجه به گزارشاتی مبنی بر وجود آلودگی در گاوهای کشور و خسارات اقتصادی حاصله بر صنعت گاوداری، طراحی و ارزیابی تستهای تشخیصی حساس و اختصاصی که توانایی تشخیص حیوانات آلوده را به منظور کنترل نئوسپورا کانینوم در سطح گله داشته باشند ضروری به نظر می رسد.
از زمان شناسایی نئوسپورا کانینوم تاکنون روش های تشخیصی زیادی برای شناسایی آلودگی دامها به این انگل ابداع شده است. از این میان می توان به روش های هیستوپاتولوژی، ایمونوهیستوشیمی، سرولوژی، مولکولی، کشت سلولی و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی اشاره نمو د
(2003 Dubey and Schares 2006 ; Dubey and Lindsay 1993; Dubey et al. 2006; Dubey )
تشخیص قطعی بر اساس آزمایش ایمونوهیستوشیمی بافتهای آلوده است. این روش معمولاﹰ برای تأیید سایر روشها و نیز برای تفکیک نئوسپورا کانینوم از توکسوپلاسما گندئی استفاده شده اما روشی وقت گیر بوده و تفسیر نتایج آن مشکل است
(Dubey and Lindsay 1993; Jones 1996; Romand et al. 1998; Dubey and ;Schares 2006; Dubey 2003).
تشخیص آلودگی عمدتا با روش های سرولوژیکی، به عنوان ابزار مهمی برای بررسی های کلینیکی و اپیدمیولوژیکی، انجام می شود (et al. 2007 Silva).
آزمایشات سرولوژیک دارای این مزیت هستند که قبل از مرگ دام قابل انجام بوده و اطلاعات کافی در مورد مرحله آلودگی فراهم می سازند (Dubey and Schares 2006). از آنجایی که تنها نشانه در معرض قرار گرفتن با نئوسپورا کانینوم، حضور آنتی بادی های اختصاصی در سرم گاو است، روش های مختلف سرولوژیک برای تشخیص آنتی بادی به کار گرفته شده که شامل IFAT، انواع الایزا وDAT هستند (et al. 1997 Williams Romand et al. 1998; Packham et al. 1998; Paré et al. 1995a; Lally et al. 1996; Conrad et al. 1993a; Björkman and Lunden 1998; ). در این روشها از تاکی زوئیت کامل یا آنتی ژن های مشتق شده از تاکی زوئیت استفاده می شود که به علت واکنش متقاطع با سایر انگلهای مربوطه مانند توکسوپلاسما گندئی باعث واکنش مثبت کاذب می شود
(et al. 1993b; Dubey and Lindsay 1993 Conrad et al. 2003; ; 1999 Chahan Bjorkman and Uggla ). همچنین به علت نیاز این آزمایشات به استفاده از مقادیر زیاد آنتی ژنهای مشتق شده از کشت سلولی، اغلب تهیه آنتی ژن و استاندارد کردن آن مشکل است و به دلیل تفاوت در میزان بقایای سلول میزبان بر اختصاصیت و تکرارپذیری نتایج تست تاثیر می گذارد (Lally et al. 1996; Jiang et al. 2008; al. 1996; et Baszler). بنابراین ضروری است که تست تشخیصی مطمئن، حساس و اختصاصی با بهره گرفتن از آنتی ژن های اختصاصی نئوسپورا کانینوم طراحی شود.
آنتی ژن های نوترکیب درمقایسه با آنتی ژن های کامل، مزایای بیشتری دارند زیرا اولا به آسانی درحجم زیاد تهیه می شوند و ثانیا به راحتی برای آزمایشات تشخیصی استاندارد می شوند. بنابراین با به کارگیری این آنتی ژن ها، نیازی به آنتی ژن های مشتق شده از کشت سلولی نیست (et al. 2003; Louie et al. 1997 Chahan).
تاکنون چندین آنتی ژن نئوسپورا کانینوم شناسایی شده اند که اغلب آنها شامل
پروتئین هایی هستند که روی سطح مراحل مهاجم انگل ظاهر می شوند مانند NcSAG1و NcSRS2که از آنتی ژن های سطحی ایمونودومینانت اصلی هستند
(immunodominant surface antigens major). علاوه بر این ، آنتی ژن هایی نیز هستند که بطور موقتی روی سطح تاکی زوئیت های انگل ظاهر می شوند مانند محتویات میکرونم، راپتری و گرانولهای متراکم. این ها ارگانل های ترشحی در ناحیه قدامی مراحل مهاجم انگل هستند و در واکنشهای فیزیکی مستقیم بین انگل و سلول میزبان نقش دارند
( Soldati et al. 2001; Sonda et al. 2000et al. 1998; Nishikawa et al. 2001a;b; Liddell Lally et al. 1997; Boothroyd 2000; Dubremetz et al. 1998; Hemphill et 1997 Black and ).
اگرچه NcSAG1 و NcSRS2 بطور واضح با همتاهای خود در توکسوپلاسما گندئی (TgSAG1 و TgSRS2) هومولوگ هستند اما میزان تشابه توالی به اندازه ای نیست
این مطلب را هم بخوانید :
پایان نامه تعارضات زناشویی:راهبردهای حل تعارض
که باعث بروز واکنش متقاطع شود، از این رو به عنوان مارکرهای تشخیصی عالی برای تمایز موثر بین نئوسپورا کانینوم و توکسوپلاسما گندئی قابل استفاده هستند (Howe et al. 1998). همچنین پاسخهای ایمنی القاء شده توسط این آنتی ژن های سطحی، آنها را به مارکرهای ایده آل برای تشخیص سرولوژیکی آلودگی به نئوسپورا کانینوم و تهیه واکسن تبدیل کرده است
Chahan et al. 2003; Gaturaga et al. 2005; Howe et al. 1998; Liu et al. 2007; Pinitkiatisakul et al. 2005 ) Ahn et al. 2003; ).
تست الایزا با بهره گرفتن از آنتی ژن های tNcSRS2 -GST و GST-NcSAG1t برای تشخیص نئوسپورا کانینوم طراحی و مورد استفاده قرار گرفته است و نتایج نشان می دهد که این تست، حساسیت و اختصاصیت بالایی دارد و واکنش متقاطعی با سرم مثبت توکسوپلاسما گندئی ندارد Liu et al. 2007 ; Pinitkiatisakul et al. 2005; Hemphill et al. 1997; l Gaturaga et al. 2005; Ahn et al. 2003; ).
اکثر تستهای تشخیصی به صورت کیت های تجاری وارداتی، پرهزینه و وقت گیرهستند و به مواد و ابزارخاصی نیز نیاز دارند که آن ها را برای کاربرد فیلدی و کلینیکی نامناسب می سازند (et al. 2005 Chahan et al. 2003; Liao )، از این رو طراحی و ارزیابی تست تشخیصی با حساسیت و اختصاصیت بالا که به ابزار اختصاصی پیشرفته نیاز نداشته باشد و در عین حال سریع و آسان انجام شود ضروری است.
تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT)) یکی از راحت ترین تستهای تشخیصی است و در حال حاضر به عنوان یک تست تجاری در دسترس برای تشخیص توکسوپلاسما گندئی استفاده می شود ( et al. 2004 Huang). در تحقیقی از تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT)) با آنتی ژن نوترکیب TgMIC3 برای تشخیص سرولوژیکی توکسوپلاسما گندئی استفاده شده که به علت اختصاصیت بالا ، کاربرد سریع و ساده،کم هزینه بودن و مناسب برای استاندارد شدن، روش تشخیصی مناسبی گزارش شده است (Jiang et al. 2008). تاکنون از این تست برای تشخیص نئوسپورا کانینوم استفاده نشده ولی از آنجایی که TgMIC3 هومولوگ NcMIC3 است و با سرم گاو آلوده به نئوسپورا کانینوم واکنش متقاطع می دهد ) Jiang et al. 2008)، در تحقیق حاضر از NcSAG1 نوترکیب به عنوان آنتی ژن برای تشخیص آنتی بادی ضد نئوسپورا کانینوم در گاو استفاده شد (2005 et al. Chahan et al. 2003; Liao).
هدف از این تحقیق طراحی و استاندارد کردن تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT)) بر اساس آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 برای تشخیص سرولوژیکی نئوسپورا کانینوم و مقایسه ی ارزش تشخیصی این تست با کیت تجاری الایزا است.
کلیات
1-2- تاریخچه
نئوسپورا کانینوم (Neospora caninum) تک یاخته داخل سلولی اجباری از شاخه آپی کمپلکسا (Apicomplexa) و بسیار شبیه توکسوپلاسما گندئی (Toxoplasma gondii) است. در ابتدا در سگ های نروژی دارای علائم عصبی مانند آنسفالیت و فلجی اندام های حرکتی انگلی شبیه به توکسوپلاسما گندئی گزارش شد (Bjerkas et al. 1984). سپس انگل در سال 1987 در گوساله های مبتلا به میلوآنسفالیت مشاهده گردید ( Anderson et al. 2000).
در یک مطالعه گذشته نگر مقاطع آسیب شناسی، نشانه های بالینی و اطلاعات آزمایشگاهی ثبت شده از 23 سگ نروژی که در آنها یک بیماری مانند توکسوپلاسموزیس تشخیص داده شده بود را مورد بررسی و با میکروسکوپ نوری و الکترونی مورد مطالعه قرار دادند. در 13 مورد عامل بیماری توکسوپلاسما گندئی تشخیص داده شد، اما در 10 مورد دیگر از سگ ها یک جنس جدید به نام نئوسپورا و گونه ای به نام نئوسپورا کانینوم که از نظر ساختمانی و آنتی ژنی متفاوت از توکسوپلاسما گندئی بود، تشخیص داده شد. به این دلیل این انگل نئوسپورا نام گرفت که از لحاظ سیر تکاملی و ریخت شناسی مشابه با
این مطلب را هم بخوانید :
3-3. دلیلبرحجیتظنونخاصه 61
3-3-1. دلیلعملبهظنمظنونالحجیه 64
3-4. ردادلهیحجیتظن 65
3-4-1. رددلیلبرحجیتظن فی الجمله 66
3-4-2. رددلیلبرحجیتمطلقظن 70
3-4-2-1. رددلیلانسداد 70
3-4-2-1-1. ردصغرایدلیل 70
3-4-2-1-2. ردکبرایدلیل 72
3-4-2-2.ردلزومترجیحراجح 74
3-4-2-3. ردوجوبدفعضررمظنون 75
3-4-2-3-1. ردمقدمهیدلیل 76
3-4-2-3-2. رداجتهادظنی 78
3-5. جمع بندی 84
فصل چهارم: ظن اخلاقی
4-1. سوءظن 89
4-1-1. تعریفسوءظن 89
4-1-2. شاخههایسوءظنوحجیتوعدمحجیتآن 90
4-1-2-1. سوءظنبهخداوعدمحجیتآن 91
4-1-2-2. سوءظنبهپیامبرواولیاءالهیوعدمحجیتآن 93
4-1-2-3. سوءظنبهمومنانوعدمحجیتآن 94
4-1-2-4. سوءظنبهغیرمومنانوحجیتآن 95
4-1-2-. 5سوءظننسبتبهخودوحجیتآن 95
این مطلب را هم بخوانید :
4-1-3. مراتبسوءظنوحجیتآن 96
4-1-4. منشأسوءظن 97
4-1-5. پیامدهاوآثارسوءظن 99
4-1-6. موارداستثناءوحجیتآن 104
4-2. حسنظنوادلهیحجیتآن 108
4-3. مهمتریندلیلعدمحجیتسوءظن، بررسیآیه «إجتنبواکثیرا منالظن ان بعض الظن اثم» 110
الف : دارای توزیع کای اسکور با درجه آزادی است .
ب : دارای توزیع نمایی استاندارد می باشد.
پ : از یکدیگر مستقل هستند.
ج : دارای توزیع با درجه آزادی است.
جائیکه :
اثبات :
ابتدا با بهره گرفتن از روش تابع توزیع نشان می دهیم که (کوچکترین آماره
ترتیبی) دارای توزیع نمایی دوپارامتری می باشد.
ابتدا تابع توزیع متغیر تصادفی را بدست می آوریم.
بنا به مستقل و هم توزیع بودن داریم.
با مشتق گیری از نسبت به داریم :
بنابراین :
درنتیجه :
در این قسمت توزیع را بدست می آوریم .
از قبل می دانیم که اگر یک نمونه تصادفی تایی از توزیع نمایی دوپارامتری باشد
آن گاه متغیرهای تصادفی دارای توزیع نمایی می باشند . داریم :
برای پیداکردن توزیع ابتدا توزیع ها را بدست می آوریم.اگر یک نمونه تصادفی تایی از توزیع جاییکه باشد،آن گاه داریم :
برای اثبات رابطه فوق (رجوع شود به فصل اول پارسیان قسمت (ط))
فرض کنید آماره های ترتیبی نمونه تصادفی باشند. چگالی آماره های ترتیبی به صورت زیر است .
نشان می دهیم متغیرهای تصادفی
مستقل و هم توزیع با توزیع می باشند.
ژاکوبین تبدیل فوق برابر است با:
و به سادگی داریم :
پس
با توجه به اینکه حدود ها به یکدیگر بستگی ندارد و تابع چگالی توأم آنها به صورت حاصل ضرب تابع
چگالی نمایی با پارامتر در آمده است ، بنابراین ها از یکدیگر مستقل و هم توزیع ( با توزیع )
می باشند .
به سادگی داریم :
با توجه به مطلب فوق
ویا
در نتیجه :
بنابراین :
در نتیجه توزیع به صورت زیر خواهد بود .
برای اثبات قسمت (ب) داریم :
با بهره گرفتن از روش تابع توزیع داریم :
جائیکه :
با بهره گرفتن از روابط بین توزیع ها داریم :
پس:
یعنی wدارای توزیع نمایی استاندارد می باشد.
برای اثبات قسمت (پ) داریم :
در قسمت های قبل نشان دادیم که برای یک ثابت دارای توزیع کای اسکور با درجه
آزادی است پس یک آماره فرعی می باشد که توزیع آن به پارامتر مجهول بستگی ندارد . همچنین برای ثابت
می توان نشان داد که یک آماره بسنده کامل برای می باشد . پس برای یک ثابت از
(طبق قضیه باسو) مستقل می باشند . حال چون دلخواه می باشد پس می توان گفت
از نیز مستقل می باشد .
برای اثبات قسمت (ج) داریم :
در اینجا صورت و مخرج عبارت را بر تقسیم می کنیم :
در قسمت های قبل نشان دادیم که و طبق قضیه باسو از یکدیگر مستقل می باشد و همچنین
و
در نتیجه :
فرض کنید دو متغییر تصادفی و دو مقدار ثابت مثبت باشند، آنگاه :
اثبات :
فرض کنید باشد. برای اثبات لِمِ (1-1) از روش عضو گیری استفاده می کنیم. فرض کنید که
عضوی از ناحیه ی باشد، ثابت می کنیم که این نقطه عضوی از ناحیه ی است.
این مطلب را هم بخوانید :
اگر داشته باشیم ، آنگاه به راحتی می توان به نتایج زیر رسید :
می دانیم که هستند. اکنون دو حالت مختلف را در نظر می گیریم :
حالت اول :
با بهره گرفتن از رابطه (1-1) داریم :
از طرفی با توجه به این که است و در این حالت می باشد، بنابراین داریم :
در نتیجه داریم :
بنابراین به راحتی نتیجه می گیریم :
حالت دوم :
می دانیم که در این حالت است . حال اگر باشد، با توجه به این که در این حالت
است و رابطه ی (1-1) نتیجه می گیریم :