پایان نامه : کلونینگ و بیان بخش‌های آنتی ژنیک سیتوتوکسین مرتبط با ژن A (CagA) هلیکو باکتر پیلوری ...

3-10 توالی یابی.. 56

3-11 انتقال پلاسمید pET-32a (+) حاوی ژن هدف به باکتری BL21 (DE3). 56

3-12 تحریک بیان ژن هدف… 56

3-13 استخراج پروتئین از باکتری.. 57

3-14 الکتروفورز پروتئینها به روش SDS-PAGE. 58

3-14-1 مراحل بستن ژل به صورت زیر انجام شد: 59

3-15 دات بلات… 61

3-16 محلولها و بافرها 62

3-16-1 بافر شستشو یا محلول TBS. 62

3-16-2 محلول بلوکه کننده 62

3-16-3 بافر شستشو یا محلول TBS-T.. 62

3-16-4 آنتیبادی اولیه. 62

3-16-5 آنتیبادی ثانویه. 62

3-16-6 روش تهیه محلول رنگ آمیزی DAB.. 62

3-17 خالص سازی پروتئین.. 64

3-18 آماده سازی آنتی ژن ایمنی زا برای تزریق به مرغ. 64

3-19 ایمنی زائی مرغ‌ها جهت تولید آنتی بادی اختصاصی.. 65

3-19-1 تزریق اولیه: 65

این مطلب را هم بخوانید :

مقالات | وبلاگ فارسی

3-19-2 تزریق‌های ثانویه  (Booster injection). 66

3-20 جمع آوری و ذخیره تخم مرغ. 66

3-21 جداسازی IgY با بهره گرفتن از روش پلی اتیلن گلایکول 14700.. 66

3-22 بررسی IgY به روش الکتروفورز SDS-PAGE و دات بلات… 67

4 نتایج و بحث… 67

4-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 67

4-2 تایید آلودگی نمونه‌های بیوپسی.. 69

4-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA.. 69

4-4 بررسی محصولات PCR.. 70

4-5 خالص سازی محصول PCR.. 71

4-6 هضم PET32a (+) و ژن CagA.. 71

4-7 کلونینگ ژن CagA در باکتری DH5α.. 72

4-8 تأیید صحت قطعه کلونشده در pET32a (+). 73

4-9 نتایج کلونی PCR.. 73

4-10 تایید نتایج کلونی PCR با بهره گرفتن از T7. 74

4-11 استخراج پلاسمید و انجام هضم آنزیمی.. 75

4-12 توالی یابی.. 76

4-13 آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسیدی CagA.. 76

4-14 بیان ژن. 78

4-15 SDS-PAGE. 78

4-16 دات بلات… 79

4-18 تولید IgY ضد هلیکو باکتر پیلوری-CagA در زرده تخم مرغ. 81

5 نتیجه گیری و پیشنهادات… 85

فهرست شکل‌ها

عنوان                                                                                                    صفحه

شکل 4-1.  نتایج نرم افزار bcepred. 68

شکل 4-2. تست اوره آز انجام شده بر روی نمونه‌های بیوپسی. 69

شکل 4-3. تعیین کیفیت و کمیت DNA. 70

شکل4-5. خالص سازی محصول PCR . 71

شکل4-6. هضم ناقل بیان و قطعه هدف… 72

شکل4-7. کشت خطی از تک کلون‌های رشد کرده بر روی محیط کشت LB-آگار حاوی آمپی سیلین.. 73

شکل 4-8. کلونی PCR. 74

شکل4-9. کلونی PCR با بهره گرفتن از پرایمر T7 و T-terminatoor. 75

شکل 4-10. استخراج پلاسمید نوترکیب و هضم آنزیمی.. 76

شکل 4-12. بررسی بیان پروتئین نوترکیب با الکتروفورزSDS-PAGE 78

شکل 4-13. دات بلات پروتئینهای استخراج شده. 79

شکل 4-14.تعیین غلظت پروتئین با بهره گرفتن از روش برادفورد. 81

شکل 4-15.خالص سازی پروتئین و حذف باند‌های غیر اختصاصی. 81

شکل 4-16. الکتروفورز SDS-PAGE به منظور بررسی پروتئین زنجیره سبک و سنگین IgY استخراج شده از زرده تخم مرغ  82

فهرست جدول‌ها

عنوان                                                                                                          صفحه

جدول 3-1 مواد و مقادیر لازم برای انجام PCR یک واکنش…. 43

جدول3-2. برنامه حرارتی مورد استفاده جهت تکثیر نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 44

جدول3-3 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت LB مایع.. 46

جدول3-4 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت جامد LB-Agar. 47

جدول 3-5 مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم قطعه هدف ژنCagA.. 48

جدول 3-6. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم pET-32a (+) 49

جدول3-7. مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش الحاق.. 50

جدول 3-8. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم پلاسمید pET32a (+)-CagA.. 55

جدول3-9. مواد مورد نیاز برای تهیه بافر Laemmli buffer samples 5X. 58

جدول3-10 مواد و مقادیر لازم جهت تهیه ژل پایینی SDS-PAGE. 58

جدول 3-11 مواد لازم جهت بستن ژل بالایی SDS-PAGE. 59

جدول3-12. مواد و مقادیر مورد نیاز برای بافر 5X تانک SDS-PAGE. 59

فهرست علائم و اختصارات