ای، گوسفند و بز دانشگاه مازندران دانشکده علوم دامی و شیلات رساله دکتری تخصصی ژنتیک و اصلاح نژاد دام

2-2 سابقه مطالعه ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در حیوانات مزرعه ای…………..37

فصل سوم…………………………………… 40

مواد و روش ها………………………………….. 40

3- مواد و روش ها………………………………….. 41

3 – 1  تهیه نمونه های خون و کشت سلول های خونی…………….. 41

3 – 1- 1 تهیه ی نمونه های خون…………………………………… 41

3 – 1- 2 کشت سلول های خونی با روش RB و انتخاب اسلاید های  مناسب برای FISH……….

3-2 انتخاب و سفارش کلون های BAC……………………………….

3-2-1 شناسایی کلون های BAC حاوی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9…………..

3-2-1-1 ژن BMPR1B…………………………………….

3-2-1-2 ژن BMP15……………………………………

3-2-1-3 ژن GDF9……………………………………

3-3 کشت باکتری های حاوی کلون های BAC و استخراج DNA………………..

3-4 نشاندارسازی DNA استخراج شده از کلون های BAC………………………

3-5 تهیه کاریوتایپ گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز………………. 51

3-6 هیبریداسیون در محل فلورسنتی (FISH)……………………………. 51

3-7 مراحل بعد از FISH…………………………………….

3-7-1 آشکار سازی سیگنال های FITC…………………………………….

3-7-2 RBPI- باندینگ…………………………………….. 53

3-8 بررسی میکروسکوپی اسلایدها و ردیابی سیگنال های FITC…………….

3-9 تعیین محل دقیق (باند کروموزومی) ژن های مورد مطالعه روی کروموزوم ها……54

فصل چهارم…………………………………… 55

نتایج……………………………………. 55

4- نتایج……………………………………. 56

4-1 کیفیت DNA استخراج شده از کلون های BAC…………….

4-2 نتایج حاصل از کشت سلولی و کاریوتایپ های تهیه شده برای گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با روش RBA- باندینگ…….56

4-2-1 کاریوتایپ RBA- باندینگ گاو (BTA)………………………………….. 56

4-2-2 کاریوتایپ RBA- باندینگ گاو میش رودخانه ای (BBU)………… 56

4-2-3 کاریوتایپ RBA- باندینگ گوسفند (OAR)………………………… 56

4-2-4 کاریوتایپ RBA- باندینگ بز (CHI)………………………………….. 57

4-3 جایگاه فیزیکی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 با بهره گرفتن از تکنیک FISH روی کروموزوم های RBPI- باندینگ گونه های مورد مطالعه…………………………………..57

4-3-1 جایگاه فیزیکی  ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو (BTA)………………..57

4-3-2 جایگاه فیزیکی  ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو میش رودخانه ای (BBU)……57

4-3-3 جایگاه فیزیکی  ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گوسفند (OAR)…………..57

4-3-4 جایگاه فیزیکی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در بز (CHI)…………………….58

4-4 مقایسه جایگاه فیزیکی ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو، گاو میش رودخانه ای، گوسفند و بز با انسان…………58

فصل پنجم…………………………………… 96

بحث و نتیجه گیری……………………………………. 96

5- بحث……………………………………. 97

5-1 نقشه های ژنتیکی……………………………………. 97

5-2 تفاوت های نقشه های فیزیکی و لینکاژی…………….. 98

5-3 ژنومیکس مقایسه ای……………………………………. 99

5-4 نتیجه گیری نهایی……………………………………. 103

5-5 پیشنهادات……………………………………. 103

واژه نامه…………………………………… 104

منابع و مآخذ…………………………………… 106

Abstract…………………………………..

چکیده:

هدف اصلی در پژوهش های ژنومی حیوانات اهلی تهیه نقشه های ژنومی جامعی است که بتواند شناسایی جایگاه های موثر بر صفات مهم اقتصادی را امکان پذیر سازد. انتظار می رود که شناسایی چنین جایگاه­هایی منجر به طراحی برنامه های کارآمد اصلاح نژادی، خصوصاً انتخاب به کمک نشانگر (MAS) و در نتیجه افزایش صحت و پیشرفت انتخاب در حیوانات مزرعه­ای شود. هدف مطالعه حاضر مکان یابی فیزیکی مقایسه ای کلون های BAC گاوی حاوی ژن های باروری فاکتور رشد تمایز یافته 9 (GDF9)، پروتئین ریخت زای استخوان 15 (BMP15) و گیرنده نوع یک آن (BMPR1B) با بهره گرفتن از تکنیک هیبرید سازی در محل فلورسنتی (FISH) برای اولین بار روی کروموزوم های R- باندینگ گاو (BTA, 2n=60)، گاو میش رودخانه ای (BBU, 2n=50)، گوسفند (OAR, 2n=54) و بز (CHI, 2n=60) با توجه به استاندارد ISCNDB 2000 بوده است. برای تهیه کروموزوم های R- باند شده با وضوح زیاد، نمونه های خون کامل از گونه های مورد مطالعه با وارد سازی دیر هنگام BrdU و Hoechst33258 کشت شدند. کلون های BAC حاوی ژن های مورد نظر از روی آخرین سازه ژنوم گاوی با توجه به گردآوری های توالی ژنوم گاوی UMD_3.1 و Btau_4.6.1 شناسایی شده و سپس از کتابخانه BAC گاوی موسسه INRA تهیه شدند. پس از کشت کلون ها، استخراج DNA و نشاندار سازی آن با روش Nick translation، اسلایدهای متافازی در حضور COT-l DNA گاوی به مدت یک شب تحت تیمار FISH قرار گرفتند. مراحل ردیابی سیگنال های FITC و تهیه متافازهای RBPI- باندینگ به ترتیب با بهره گرفتن از سیستم آنتی بادی های FITC-avidin و anti-avidin و رنگ آمیزی اسلایدها با پروپیدیوم آیوداید انجام شد. تجزیه و تحلیل FISH موقعیت دقیق فیزیکی و باندهای کروموزومی مربوط به ژن های مورد مطالعه را روی متافازهای گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز نشان داد. جایگاه دقیق فیزیکی ژن BMPR1B در گاو، گوسفند و بز یکسان بود (BTA/OAR/CHI6q15). در گاومیش رودخانه ای، ژن BMPR1B روی موقعیت BBU7q21 مکان یابی

این مطلب را هم بخوانید :

مقابله با استرس

 شد. ژن BMP15 در گاو و گاومیش رودخانه به ترتیب روی BTAXq31 و BBUXq36 و در موقعیت همولوگ (OAR/CHIXq24) در گوسفند و بز مکان یابی شد. برای جایگاه GDF9، موقعیت های کروموزومی BTA7q22.3، BBU9q24، OAR5q22.3  و CHI7q22.3 به ترتیب برای گاو، گاومیش رودخانه ای، گوسفند و بز شناسایی شدند. داده های حاصل شده از مطالعه حاضر علاوه بر توسعه نقشه های سیتوژنتیک گونه های مطالعه شده باعث توسعه اتصال نقشه های ژنتیکی روی باندهای اختصاصی کروموزومی شده و همچنین می تواند برای مطالعات ساختاری و عملکردی دقیق تر ژن های اخیر مخصوصاً در گاوسانان مورد استفاده قرار گیرد. انتظار می رود که علاوه بر ردیابی دقیق موقعیت مکانی ژن ها روی کروموزوم ها، بتوان هر چه بیشتر از تکنیک های مبتنی بر سیتوژنتیک مولکولی در مطالعات مرتبط به شناسایی نواقص کروموزومی و امکان ارتباط آن ها با صفات اقتصادی، خصوصاً صفات تولید مثلی در دام های اهلی استفاده نمود. قابل ذکر است که شناسایی موقعیت مکانی ژن ها روی کروموزوم ها، منجر به این خواهد شد که ردیابی QTLها در حوالی این ژن ها هر چه سریع تر و با هزینه کمتر گیرد.

فصل اول: مقدمه و کلیات

1-1- مقدمه

هدف اصلی در پژوهش های ژنومی حیوانات اهلی تهیه نقشه های ژنومی جامعی است که بتواند شناسایی جایگاه های موثر بر صفات مهم اقتصادی را امکان پذیر سازد. انتظار می رود که شناسایی چنین جایگاه­هایی منجر به طراحی برنامه های کارآمد اصلاح نژادی، خصوصاً انتخاب به کمک نشانگر (MAS) و در نتیجه افزایش صحت و پیشرفت انتخاب در حیوانات مزرعه­ای شود. اگر چه نقشه های ژنتیکی که تا کنون برای حیوانات اهلی تهیه شده ­اند برای ردیابی ژن ها و جایگاه های صفات کمی در فواصل 10-5 سانتی مورگان (cM) و شروع برنامه های MAS کفایت می کنند، اما شناسایی دقیق جایگاه فیزیکی ژن ها و سپس کلونینگ و ردیابی واریانس های ژنتیکی آن ها و در گام بعدی مطالعه ارتباط این واریانس ها با صفات اقتصادی در اکثر موارد به ویژه در نژادهای موجود در کشورهای در حال توسعه از جمله ایران، به پژوهش های بیشتری نیاز دارند. به کارگیری داده های ژنوتیپی در ارزیابی های ژنتیکی تجاری و استراتژی های انتخاب بهینه، از جمله چالش های اصلاح نژادی می باشند که قطعاً نیازمند پیشرفت های بیشتری هستند.

کاربرد سیتوژنتیک در دام های اهلی از تکنولوژهای مفید برای توسعه ژنتیکی دام های اهلی است. سیتوژنتیک می تواند برای انتخاب حیوانات مولد فاقد نواقص کروموزومی مسئول نواقص فیزیکی (آنیوپلوئیدی)، باروری کمتر (نواقص بالانس کروموزومی) یا ناباروری (نواقص کروموزوم های جنسی) استفاده شود. همچنین سیتوژنتیک می تواند برای بررسی آلودگی های محیطی با مطالعه حیوانات موجود در مناطق آلوده و استفاده از آن ها به عنوان شناساگرهای بیولوژیکی استفاده شود (یانوزی، 2007).

مک کوسیک (1980) پیشنهاد داد که ژنوم را به عنوان بخشی از آناتومی باید مورد توجه قرار داد. آناتومی ژنوم هم از نگاه ساختاری و هم از نگاه عملکردی برای موجودات بسیار مهم است. آنالیز ژنوم گونه های